1. m6A修饰在细胞核中的功能

为研究m6A修饰在细胞核中的功能，研究者分析了两个独立的METTL3基因敲除（METTL3 KO）的mESCs，并分析了METTL3敲除对新生转录本和染色质状态的影响。

结果显示，与WT相比，METTL3 KO mESC的新生转录本合成(Fig.1A)和染色质的可及性(Fig.1C)显著增加。并且，在增加一个稳定的救援细胞系（表达WT和mut METTL3）后，WT逆转了新生转录本和染色质可及性的增加，mut METTL3 并未逆转(Fig1B和1D)，表明METTL3通过m6A修饰依赖的方式调控转录。

Fig.1 m6A修饰与转录本合成和染色质可及性的关系

2. m6A修饰对染色质相关调控RNA(carRNA)的影响

接下来，从可溶性核质和染色质相关组分中分离了rRNA，并通过LC-MS/MS对m6A进行定量。发现在METTL3 KO后，非rRNA染色质相关（caRNA）中的m6A下降最多(>50%)(Fig.2A)。

进一步分析三种具有潜在调控功能的caRNA：启动子相关RNA（paRNA）,增强子RNA（eRNA）和自转录因子转录的RNA（repeat RNA），将其统称为染色质相关调控RNA（carRNA）。在METTL3 KO mESC中，这些carRNA的m6A水平显著降低(Fig.2B)。

将carRNA分为m6A标记和非m6A标记两组，在METTL3 KO后，m6A标记的转录本RNA丰度显著升高(Fig.2C)，且carRNA的m6A水平变化与表达水平呈负相关。

先前研究发现YTHDC1与靶向核外泌体(NEXT)的复合物相互作用，NEXT负责某些非编码核RNA的降解。因为YTHDC1是已知的m6A核Reader，并且YTHDC1 CKO可以诱导转录上调。所以假设YTHDC1能识别m6A标记的carRNA，并且通过NEXT触发其降解。

通过MeRIP-seq和敲除实验，发现YTHDC1和METTL3类似，YTHDC1 CKO后，m6A水平升高，且三组carRNA的半衰期均显著增加(Fig.2D)，并且有m6A标记的carRNA半衰期变化更大(Fig.2E)。

Fig.2 m6A修饰对carRNA的影响

3. METTL3通过什么影响转录？

carRNA可以通过影响基因组相应位点的染色质结构来调节转录，METTL3 KO增加了转录和染色质的可及性。那么，METTL3是否通过影响carRNAs的m6A修饰，从而影响了染色质状态呢？

对新生转录本以及核total RNA进行时序RNAseq，并对METTL3 KO和WT mESC进行了天然延伸转录本测序(mNET-seq)。总体核RNA表达水平和转录速率都随着METTL3 KO的增加而增加(Fig.3C和3D)，在Mettl3 KO mESC中被上调的基因具有更多被m6A标记的上游carRNA(Fig.3A和3B)。带有m6A标记的上游carRNA的基因具有更高的转录速率(Fig.3E和3F)。所有m6A依赖基因在METTL3 KO后，均显示出上游carRNA甲基化减少并且转录速率增加的现象(Fig.3G)。

以上结果表明在METTL3 KO后，carRNA的m6A甲基化减少，激活了下游基因的转录。

Fig.3 METTL3影响转录的方式

4. carRNA的甲基化修饰对染色质状态变化的影响

接下来作者转向研究受到改变的carNRA甲基化对染色质状态变化的影响。

对此，作者进行了ChIP-seq试验，观察到在METTL3 KO后，两个活性标记H3K4me3和H3K27ac水平总体增加，且具有m6A标记的上游carRNA具有更大的H3K4me3和H3K27ac的增加(Fig.4A)，表明稳定METTL3 KO mESC中的上游carRNA可以增加活性组蛋白标记的沉积。

那么carRNA是怎么促进染色质开放并激活转录的呢？

作者怀疑carRNAs可以募集CBP/EP300和YY1等蛋白来促进染色质开放并激活转录。因为YY1是带有m6A标记的carRNA的基因组区域中最富集的转录因子之一，并且ChIP实验揭示了METTL3 KO mESC中EP300和YY1结合力的增加(Fig.4B和4C)。此外，EP300和YY1结合都与附近carRNA的m6A水平呈负相关(Fig.4D和4E)。在对抑制因子（JARID2）的ChIP-seq分析中，发现RNA转录本可以排斥抑制因子以维持染色质的开放。

因此，m6A调控的carRNA不仅可以通过募集活性组蛋白，而且可以在甲基化丧失时排斥PRC2等抑制因子，从而稳定染色质的开放状态。

Fig.4 carRNA的m6A修饰对染色质状态的影响

在小鼠胚胎干细胞中敲除METTL3和YTHDC1可以通过m6A依赖的方式提高染色质的开放性并激活转录；

当敲除METTL3或YTHDC1时，carRNA的增加会提高染色质的开放状态并促进下游基因的转录；

m6A调控的carRNA通过募集活性蛋白和排斥抑制因子的方式，稳定染色质的开放状态；

该研究首次揭示了m6A修饰和染色质状态的关系，为m6A功能研究打开了新的大门。

END

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